白癜风治疗方法 http://news.39.net/bjzkhbzy/171226/5959473.html大家好，我是Claire，是北京普华量宇科技有限公司的。今天和大家分享的内容呢，包括两个方面的研究，一个呢是肿瘤，很多人都是谈癌色变，而根据咱们国家癌症中心的报告，平均每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟就会有7.5个人被确诊为癌症。这样的一个数据呢，也就提示目前癌症越来越普遍化，而我们必须要加快对肿瘤的研究。另一个呢是最近困扰我们的新冠病毒。最近这几天，国外的感染人数越来越多，其实早在3月11号，WHO总干事就宣布，世卫组织经过疫情评估后，认为新冠肺炎已经构成“全球性流行病”，这不仅意味着疫情严重程度的升级，也意味着抗疫难度的升级。所以目前对于新冠病毒这类传染性疾病的研究已经是迫在眉睫。
接下来的时间，我会从肿瘤和传染性疾病这两个方向入手，分别从不同的样本类型，比如说单细胞和组织，为大家进行分享。
我们首先来看肿瘤研究部分。我们会着重分享循环肿瘤细胞的PD-L1这个免疫检查点抑制剂的相关研究，还有肿瘤微环境和免疫微环境方面的研究。
我们都知道，T细胞正常运作的时候呢，是能够识别和攻击肿瘤细胞的。但是当肿瘤细胞的PD-L1蛋白与T细胞上的PD-1受体结合，T细胞就无法识别到肿瘤细胞，肿瘤细胞就开启了免疫逃逸。这个时候如果能有一个抑制剂出现，去阻断PD-L1蛋白和PD-1受体的结合，T细胞就可以正常的发挥功效了。其实这几年，对于免疫检查点抑制剂的研究也很多，大多都是PD-1/PD-L1这条通路的。这个IRF1干扰素调节因子1，是一个重要的“核”多功能转录因子，可以控制细胞周期和凋亡，抑制肿瘤的形成。其实在很多的癌症中，比如肺癌、黑色素瘤等，他们细胞中的IRF1与PD-L1的高表达是密切相关的。
这个实验的目的呢，就是测定乳腺癌患者中PD-L1和IRF1表达之间的关系。方法是对两名乳腺癌患者的PBMC富集，然后进行6个靶点的染色，再去成像和分析。
这是RareCyte平台的一个工作流程，首先将全血加入一个有专利的分离管中，这个分离管有几个特点，首先呢，它是基于密度的原理进行分离的，不需要加入红细胞裂解液，所以对细胞的RNA不会有损伤；其次呢，这个管子里有一个黑色的浮漂，它的密度和有核细胞的密度一样，所以进行离心之后，可以看到分了三层，最下面那层是红细胞，上面那层是血浆，而中间那层使我们想要富集的有核细胞，会卡在凹槽里。通过压接机把一个金属环套在分离管外面，相当于把浮漂固定住，这样最底层的红细胞和上面是不能产生交换的。然后呢，我们把上层的血浆吸出去，在加入一种置换液，置换液的密度比有核细胞的密度大，再一次离心的话，有核细胞就会到上层来，然后我们就可以进行收集。收集完有核细胞，我们进行涂片，类似于组织切片，我们把所有的有核细胞涂在片子上，然后固定这些细胞，就像染组织切片一样对这些细胞进行多靶点的染色，最后再去成像。
我们来看一下结果。左边的这是对两个乳腺癌患者的PBMC6个靶点染色后的成像结果，下面的是40X物镜分别率的成像，可以看到，紫色的染的是核，绿色的是IRF1，它是一个核上表达的marker，蓝色的是PD-L1，表达在膜上的蛋白。我们分别对PD-L1和IRF1的平均荧光强度进行计算，可以看到高PD-L1表达的这些循环肿瘤细胞，它们的IRF1的表达量也是高的，大概是在1.4到3.3倍，这也就说明了IRF1与PD-L1的高表达是密切相关的。
我们知道目前免疫检查点抑制剂在临床上是取得了非常辉煌的战绩，但是呢，它依旧面临着一些困境。我们还是以PD-1和PD-L1这个通路来说，主要是有这么两重困境。首先呢，是患者筛选问题，也就是寻找有效的生物标记物的问题。根据粗略的估计呢，大约只有30%的患者能从免疫治疗中获益，大多数的患者他们个体的差异性非常大，虽然目前预测免疫检查点抑制剂疗效的生物标记物有很多，但还没有一个是万能的。不管是TMB，也就是肿瘤突变负荷，还是癌细胞PD-L1的表达水平，他们都有一定的问题，而且应用的范围也比较有限。当然有人会说，联合使用多种标记物去预测疗效可不可以。当然可以，这是目前很多研究团队努力的方向，尤其是要联合PD-L1和TMB，但是，这些个相互独立的指标，究竟要如何联合使用，才能产生最优解的疗效？目前这是未知的。我们想要去研究这个方向，就必须要对循环肿瘤细胞进行使用多靶点精准分型。我们再来看第二重困境。就是疾病的超进展问题。意思是说呢，这个患者通过治疗以后，病情非但没有好转，反而恶化了。这不是个别现象，之前有一些数据表明至少有百分之十几的患者会发生疾病超进展。而目前我们对于疾病出现超进展的原因是所知甚少的。去年4月份，日本国立癌症研究中心，发表了一篇研究，他们发现，在一部分患者体内，抑制免疫活性的调节性T细胞也会表达PD-1。当这些患者接受PD-1抗体治疗之后，这些调节性T细胞的增殖能力和免疫抑制能力都增强了。而杀伤性T细胞被抑制的就更严重了，癌细胞就可以趁着这个机会发展壮大，也就是疾病超进展。所以说，如果在使用PD-1和PD-L1抑制剂的时候，对免疫系统的其它通路产生影响，就极有可能会有意想不到的结果。这个问题我们也可以通过多靶点精准分型来解决。总结来说呢，多靶点的染色是非常重要的，不管是在细胞还是组织样本上，比如要做不同蛋白的共表达和共定位分析，或者低丰度分子的检测，还有异质性的分析等等，这些都要靠多个marker共同进行研究。
我们再来看一下，在组织上如何进行肿瘤的研究。
这项研究呢，是麻省理工大学和哈佛一起做的，使用了一种循环染色的方法，对组织做了多靶点全景成像，然后分析在免疫分型中的一些应用。它的方法呢，就是先进行3个marker的染色，全景成像之后洗掉，再去染另外三个marker，再成像洗掉，这么循环8次或者10次等等，通过套准和拼接，把这些图像组装成高维图像。这样的方法呢，其实可以去追踪到肿瘤样本中60多种不同的蛋白质。这样可以去揭示癌症期间破坏的分子机制，也可以揭示单个肿瘤的复杂性，还可以去查明哪些免疫细胞参与了抗击肿瘤的工作。也就是我们说的肿瘤微环境和肿瘤免疫微环境。相信大家都知道，这两个目前是非常热的两个研究领域。我们一起看一下这项研究在肿瘤微环境和免疫微环境中应用。
这是一个转移性的黑色素瘤的病灶和它相邻的良性组织的一个成像结果。我们可以看到，绿色的肿瘤细胞是被包围在记忆T细胞，白色的这个，和红色的阳性基质中间的。通过放大，我们还可以看到CD4T细胞和CD8T细胞，以及跟细胞增殖有关的一个标记物pRB。
这个呢，是胰腺导管腺癌的一个微环境。我们可以看到3个比较大的区域，左上角是正常的胰腺组织，右下角是小肠，而右上角就是它的癌组织。分别对这三个区域中的黄色框里的区域进行研究。
先来对小肠这个区域进行循环染色，然后成像，总共是8轮染色，24个Marker，我们可以看到单个视野成像的结果。然后把其中四种marker拿出来，对它们的位置分布情况和荧光强度进行分析。还可以对小肠这个区域的大约个细胞中的24种蛋白质进行单细胞定量信号强度的测定。也就是E图所展示的这个结果。前三个E-钙粘蛋白，角蛋白和β-连环蛋白他们彼此之间是高度相关的，而最下面的波形蛋白和VEGFR2受体的表达水平是反向相关的。其实也就是说明了正常组织和癌组织中，他们上皮和间质细胞状态之间的二分法。意思也就是说上皮和间质蛋白的表达是相抗的。
对高维的单细胞进行分析，A图呢我们可以看到小肠和胰腺癌组织的细胞，基于t分布的一个SNE非线形降维图。这里选的四种Marker，PCNA和Ki67是和细胞增殖有关的，但他们在刚才展示的E图上，是相抗的关系；同样的pERK和β连环蛋白是和信号通路有关的蛋白，他们也是相抗的关系。我们以pERK和β连环蛋白为例，可以很明显的看到小肠和胰腺癌这两种组织存在显著的异质性。
当把t-SNE应用到样本中所有细胞的时候，我们发现在组织病理学检查中，鉴定为非肿瘤性的胰腺，红色的，就是正常的胰腺组织和绿色的癌组织以及相邻的非肿瘤性的小肠，蓝色的，它们之间是不同的。比如红色圈住的这张图像，我们可以看到波形蛋白和E-钙黏着蛋白在癌组织和正常胰腺中的表达水平差异很大，这其实是恶性组织中上皮到间质转化的结果，也就是我们说的EMT，而且呢，它是有致密的肿瘤基质存在的，这种增生反应其实是肿瘤微环境的一个标志。与正常胰腺相比，我们还可以看到癌组织的微环境其实被CD45+免疫细胞浸润的程度会更高。而且呢，小肠的肠粘膜也充满了免疫细胞，这其实与我们已经认识到的小肠组织是相符的。
刚刚我们也提到免疫检查点抑制剂的一个困境就是，不同的癌症类型和不同的药物反应是有很大差异的，也就是癌症患者个体化的差异。我们希望呢，从免疫分型上能够找到预测患者治疗反应的生物标记物。这个结果呢就是在，肾癌样本上，进行了循环染色。A图的右上部分呢，是α-SMA阳性基质较低的区域，表示富含恶性肿瘤细胞的区域；而左下部分呢，红色表达较高，我们可以认为是没有病变的细胞。按照这个划分呢，我们可以看到在肿瘤区域呢，CD3或CD8T细胞所占的比例呢，比非肿瘤区域高了将近四倍；而PD-1和PD-L1则高了将近13-20倍。
我们知道，肿瘤细胞是通过PD-L1配体和免疫细胞的PD-1受体结合，从而开启免疫逃逸，可以通过估计配体-受体相互作用的可能性，去量化，表达这两种分子的细胞的共定位程度。G图中黄色的区域就是细胞间距小于10mm，具有高空间密度的共定位的这些细胞。在肿瘤的区域，大约是非肿瘤区域的2.7倍。也就是说，黄色的这些区域他们的PD-1和PD-L1更容易相互作用。从这个图，我们其实还可以看到这些黄色区域大都集中在肿瘤和基质的边界上，这和之前有关于黑色素瘤的报导，结果其实是一样的。总结来说呢，这些数据最终可能会帮助我们找到，可以预测免疫检查点抑制剂，高敏感性的这类生物标记物。
其实我们还可以通过精准免疫分型，对多种肿瘤进行类型和等级的划分。这里呢，是选择了13种癌症，B图里的1代表是正常的组织，2是前期的肿瘤，3则是恶性肿瘤。然后做了t-SNE和聚类的分析，能得到两个结果，E图呢，是总体而言，无论等级如何，正常组织和肿瘤之间都没有分离。F图，我们只看ST胃癌和PA胰腺癌，可以看到呢，即使是来自多个不同的组织，它们的恶性肿瘤，也就是3号，是一个聚集的状态，这就表明了癌种转化的形态其实和细胞的状态是密切相关的。所以这也是给我们提供了一个鉴定生物标志物的方法，就是通过有效的分类和抗原定位，找到替代性的抗原。
单细胞基因组学呢，是可以揭示很多癌症的异质性的。对胶质母细胞瘤进行循环染色和成像，B图我们可以看到，它的分辨率是可以看到单个细胞的。选取个视野，对它们进行香浓熵值的归一化处理，处理之后大于个细胞的视野我们展示在C图上。熵值的大小呢，其实就是衡量细胞间异质性的尺度。比如EGFR这个标志物，它的作用是驱动癌基因，它的熵值在某些区域非常的高，但是也有一些区域比较低。EGFR高的区域呢，和下游的信号蛋白，比如pERK，他们之间变化最大的区域是不相关的。这也就说明了，局部异质性的程度会随肿瘤区域和标记物的变化而变化。关于这项研究，更多的细节呢，大家可以去找原文看一下。
这是用RareCyte平台里的多色试剂盒染的扁桃体的石蜡切片，染了包括核在内的7个marker。
这分别是两个视野的。这个试剂盒是组织和细胞通用的试剂盒，你可以根据不同的癌种，去组合里面的marker，比如说做乳腺癌的，你还可以加上HER2，ER，PR等等。
跟大家分享完肿瘤研究的内容呢，我们接下来一起看一下传染性疾病的研究。主要以新冠肺炎为主，RareCyte平台可以从三个方面去助力新冠病毒的研究，第一呢，是新冠病毒的感染机制。俗话说，知己知彼百战百胜。如果我们想要正确、科学的去找到应对新冠的方法，就必须要先了解这个病毒是如何侵染细胞、破坏人体的。二呢，是细胞疗法，细胞疗法是说我将正常的或者生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者的体内，新输入的这些细胞可以替代受损细胞，或者它具有更强的免疫杀伤功能，从而可以达到治疗新冠肺炎的目的。细胞疗法呢，按照细胞的种类其实可以分为免疫细胞治疗和干细胞治疗。这两部分，我们在一会儿的内容中都会提到，比如异体CAR-T细胞治疗和间充质干细胞治疗等。第三个方面呢，是新冠病毒疫苗的研究，不管是普通民众还是媒体现在都非常关心新冠疫苗的动态。但其实新疫苗的诞生，是一个复杂且漫长的过程，它要经历4个阶段，从前期的筛选疫苗毒株，然后去进行疫苗研究，临床前研究，再去上到临床试验，临床试验又要分为3期。最近这几天呢，已经有首批的志愿者陆续的接种了疫苗。而RareCyte平台呢，不仅可以做疫苗的临床前研究，也可以在临床试验这块儿添上一把力。接下来，我会从这三个方面分别为大家介绍一些实例，这些例子呢，都是这个平台之前有文献支持的例子，希望能给到现在正在做新冠的老师和同学一些新的想法或者一些小的启示。
关于新冠肺炎呢，英国帝国理工大学和公共卫生研究所的专家们根据已经公开的数据和流行病学模型，撰写了五份报告，分别推测和分析了疫情的播散范围、严重性、传播性、病死率和基因变异可能性。而最近呢，北大和中科院巴斯德研究所共同发表了一篇研究，发现新冠病毒已经演化出L和S两个亚型。这两种亚型的传播能力、致病严重程度可能都存在很大的区别。所以下一步对于不同Type的深入研究，将对新冠肺炎的差异化治疗和防控可能有很大的帮助。我们这个平台呢，目前可以做与新冠有关的各种细胞，比如血液中的稀有免疫细胞和干细胞，体液中的这些上皮细胞，另一方面，我们也可以做感染的组织，比如肺部组织的石蜡切片或者冰冻切片。接下来我们可以一起来看一下。
我们都知道，抗体对于治疗这种感染性疾病是非常重要的。针对病毒的这种抗体可以高度有效地阻断病毒进入细胞内，也就是说把病毒隔在细胞之外，但对于已经进入细胞内的病毒，抗体是无能为力的，同时，抗体也只能是阻止大部分病毒入侵细胞，但总会有一小部分逃过抗体，进入细胞内。对于躲藏在细胞内的这些病毒，它们最终的杀死其实依赖于我们人体的T细胞。这种T细胞我们把它叫做抗原特异性T细胞。
T细胞是怎么样变成了这种抗原特异性T细胞的呢。其实，T细胞可以通过表面的抗原受体，我们叫TCR，去识别多肽抗原，然后去活化特定的细胞表面标志物，比如说CD25，CD，CD69等等。接着呢，T细胞会释放细胞因子、克隆扩增，就成为了抗原特异性T细胞。对抗原特异性T细胞的研究呢，有助于我们去理解免疫应答的差异性，因为新冠病毒引起的免疫应答，或者说它引起的临床症状是千差万别，有轻症有无症状，重症有非常严重的肺炎致死等等。那么，个体的差异在哪里？免疫应答的差异在哪？到底是抗体产生每个人是不一样的，还是说T细胞的问题？这些都有待于进一步的研究和发现。
这个研究呢，是关于稀有的Merkel细胞病毒的。这是波士顿大学医学院做的一个研究。这种Merkel多元癌细胞病毒是在皮肤里的一种DNA病毒。之前就发现，这种病毒通过克隆会把自身的T抗原的一个癌蛋白去整合到宿主的DNA中，通过一系列的突变，最后会持续地表达这个癌蛋白。这个过程呢，其实与新冠病毒入侵细胞的过程是类似的，都是把病毒自身的遗传物质整合到宿主细胞中去。这个研究的目的呢，是检测Merkel细胞癌的抗原特异性T细胞，它的TCR。
实验方法呢，第一步先对Merkel细胞癌患者的PBMC进行染色，然后去成像，识别出我们想要的那一类T细胞。
这就是成像和识别后的一个结果。我们可以看到，如果用流式细胞仪去做这种稀少的T细胞会存在两个问题：一是流式很难去设置“门”，也就是分群，意思是说对于这类非常稀少的细胞流式是做不了的。第二个问题，我们可以看到右下角的这两排，如果是在流式中，可能会认为这两个细胞也是我们想要的抗原特异性T细胞。然而其实呢，它们并不是。因为作为同一个细胞而言，无论你做了何种抗原的染色，它的细胞形态都应该是一致的，但是后两个你看到，CD3、CD4和四聚体它的形态是有很大差别的，所以后两个我们认为它并不是我们想要的抗原特异性T细胞。这也就是流式的第二个问题，分选的样品中如果发生了交叉污染的情况，流式是不能区分real和notreal的细胞的。而我们RareCyte平台，是可以很好的解决流式的这两个问题，换句话说，可以高敏感的、高特异性的去鉴定出抗原特异性T细胞。
在这个过程中其实用到的是我们CyteFinder成像系统和CyteMapper的智能识别数据库，找到这类稀少的T细胞之后，使用CytePicker模块可以进行单细胞的提取，这个提取过程呢，是一个物理过程，不会产生任何的热量，对细胞的RNA不会有损伤。提取完还有一个确认的一步，之后再去做单细胞测序等一些下游的分析。目前，波士顿大学医学院还在进行Merkel细胞癌后续的研究，包括利用单细胞的RT-PCR方法对抗原特异性T细胞进行高度敏感和详细的表征。一旦有了研究结果呢，我们也会很快的分享在我们的
当前时间： 
E-Mail: