细胞治疗近年来取得飞速发展，并在一系列肿瘤治疗中取得令人瞩目的疗效。例如，靶向B细胞抗原CD19的嵌CAR-T细胞，对某些复发和/或难治性的B细胞恶性肿瘤(特别是急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤)患者极为有效，能够维持持久的治疗效果；靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T细胞也显示出强大的抗肿瘤活性，并已获批在多发性骨髓瘤患者中进行临床使用；此外，体外扩增的自体肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)，在晚期实体肿瘤患者中显示出强大的抗肿瘤活性，特别是在患有黑色素瘤的患者中。
年10月，《Naturereviewsclinicaloncology》发布了宾夕法尼亚大学StevenM.Albelda教授撰写的题为“CARTcelltherapyforpatientswithsolidtumours:keylessonstolearnandunlearn”的综述文章，系统性地阐述了细胞治疗当前面临的困境——即CAR-T细胞在大多数实体肿瘤中的疗效仍然难以确定。Albelda教授结合自身实际经验，提出能够对抗实体瘤的CAR-T细胞的关键特征，并讨论了当前临床试验中实现这些特定特征所采取策略的合理性和可行性。同时，指出一些需要从CAR-T细胞治疗血液瘤临床试验中摒弃的教训，并汲取CAR-T细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在实体瘤中一些成功的经验。
“细胞知聊”强烈推荐CAR-T细胞治疗研究人员细读原文，本文并没有空洞地提出口号式的研究困境，而是根据来自一线的经验数据并结合大量相关报道，系统性地思考并阐述了当前困境，并提出较大可能获取成功的策略。
为什么CAR-T细胞在实体肿瘤中失败?
与在B细胞恶性肿瘤患者中的成功相比，CAR-T细胞在治疗实体瘤方面显得力不从心。目前我们了解到的是，临床数据表明，实体瘤患者血液中CAR-T细胞的数量通常在输注后7-14天内达到峰值，第28天时就降至较低水平。此外，实体瘤患者血液样本中检测到的CAR-T细胞数量，通常比血液瘤CD19CAR-T细胞的数量低约五到十倍。
不幸的是，我们对为什么绝大多数CAR-T细胞在实体瘤患者中，只显示出较小的临床活性知之甚少，这是因为很少有数据使用一系列成像或输注后的活检样本评估CAR-T细胞在人体内的迁移。此外，甚至更少的研究评估了输注后从肿瘤中分离的CAR-T细胞的功能活性。
因此，对于基本问题，例如：(1)有多少CAR-T细胞进入肿瘤；(2)它们到达后是否会增殖或持久存在；以及(3)它们能够保持多长时间的功能，我们还缺乏答案。没有这些关键问题的答案，很难知道在哪里以及如何进行必要的改进。
细胞治疗动物模型的进退两难
由于临床数据非常有限，对CAR-T细胞在体内活性的了解主要来自两类小鼠模型。大多数研究将人源CAR-T细胞注射到免疫缺陷的小鼠(通常是NSG小鼠)体内，这些小鼠携带的肿瘤来自人癌细胞系；另一种较少使用的方法是将鼠源CAR-T细胞(通常在清淋后)注射到免疫健全的小鼠体内，这些小鼠携带鼠的肿瘤(syngeneictumor，主要在皮下)。
这两种模型与理想的动物模型存在差距，但研究人员目前认为，相比之下，将人T细胞注入NSG小鼠的模型更具有信息价值，因为鼠和人T细胞之间存在许多差异，使用与临床试验中相同的人源CAR-T细胞进行临床前研究将更具相关性。也有科研人员尝试使用免疫重建的人源化小鼠，即通过使用CD34+干细胞或胚胎组织，重建具有人免疫系统的免疫缺陷小鼠。然而，这种模型仍具有挑战性，包括不完全的免疫系统重建、高昂的成本、荷瘤困难、异种反应性等。
此外，细胞数量上的不一致使得从动物转化到人十分困难。当前在实体瘤小鼠模型中测试的细胞数量，通常在10^6到10^7个CAR-T细胞之间，直接推算会转化为向患者输注10^10至10^11个CAR-T细胞，这远超临床试验中使用的数量，可能使制造变得困难，并会产生毒性效应。
了解CAR-T细胞在实体肿瘤中失败的原因
CAR-T细胞在体内的转运
1)来自动物模型的结果
CAR-T细胞研究和开发中需要回答的两个基本问题是，静脉输注后T细胞去了哪里，以及它们进入肿瘤后的效果如何。因此需要借助以下两种技术：
肿瘤活检采样：目前已在临床前动物研究中广泛应用，但来自实体瘤患者中的活检由于患者的不适和费用，活检样本的获取受到严格的限制。
CAR-T细胞成像：通常使用PET或单光子发射CT(SPECT)成像进行详细考察。对CAR-T细胞进行直接放射性标记，也可以实现高灵敏度的检测，但通常半衰期相对较短(3天)，仅允许短期数据收集。对T细胞进行基因编辑，携带编码荧光酶或其他酶的基因，也是一种方法。
科研人员利用上述两种技术考察了人T细胞在NSG小鼠体内的分布，结果显示，T细胞首先在肺中积聚，在注射后的12-24小时，T细胞定位到肝脏和脾脏，有少量定位在骨髓和淋巴结。初始的肿瘤特异性摄取通常非常有限，随着时间延长(几周后)，肿瘤内CAR-T细胞的数量逐渐增加。
过继转移的小鼠CAR-T细胞在免疫健全小鼠体内的分布，与上述人CAR-T细胞在NSG小鼠体内的分布相似，不过在肿瘤内蓄积倾向于发生略早，另外，与人CAR-T细胞不同，转移的小鼠T细胞数量在注射后约7-10天达到峰值，随后细胞消失。通常不会发生像人T细胞那样，在肿瘤内增殖和CAR-T细胞数量随时间增加的情况。
总的来说，临床前数据表明，注射的CAR-T细胞最初只有很少进入肿瘤。注射到同基因小鼠中的小鼠T细胞仅持续几周，而注射到免疫缺陷小鼠体内的人CAR-T细胞似乎在数周内增殖，从而在肿瘤内积聚。
2)来自临床试验的结果
CAR-T细胞注射到实体瘤的患者体内会发生什么？一些研究报告表明与两种小鼠模型中观察到的模式相似，CAR-T细胞首先在肺和次级淋巴器官中蓄积，随后在24-48h内非常低效地转移到肿瘤中。同时，在年6月发表的一项在头颈鳞状细胞癌患者的研究中，使用In标记的CAR-T细胞进行瘤内注射48小时后，未检测到全身系统的CAR-T细胞。
为什么肿瘤转运如此受限？
在T细胞穿越进入肿瘤基质过程中，周围血管细胞、细胞外基质蛋白和间质基质细胞会构成屏障，导致只有很少的数量最终进入癌细胞富集区。杀死肿瘤细胞的过程需要与肿瘤细胞上的ICAM1结合，而这个过程效率极低，只有极少数T细胞成功与肿瘤细胞相互作用。导致这种低效率的原因，包括趋化因子-CCR不匹配，粘附受体的缺陷和细胞外基质屏障(图1)等。
图1：靶向阻断CAR-T细胞的屏障
另一个重要但未被重视的问题是CAR-T细胞可能被“误导”进入淋巴组织，远离实体肿瘤。目前，CAR-T细胞的制造主要是根据CD19靶向产品在白血病和淋巴瘤患者中的数据来指导的，强调进入淋巴结和骨髓发挥抗肿瘤作用的重要性。已知表达高水平CCR7和CD62L的T细胞更倾向于转运到淋巴结或骨髓，而当前大多数生产方案的目标，是获得具有中央记忆细胞表型(CD62L高CCR7高CD45RO+)而不是效应记忆细胞表型的CAR-T细胞(图2)，后者通常不利于肿瘤的转运。
图2：与循环T细胞相比，CAR-T细胞产品在中枢记忆T细胞中高度富集
CAR-T细胞的持久性
在几乎所有的实体瘤试验中，血液中CAR-T细胞DNA拷贝数为每微克10^3到10^4个不等，而CAR-T细胞仅在输注后的一个月内可检测；相比之下，治疗白血病患者的靶向CD19CAR-T细胞的大多数试验中，血液中通常可以检测到高数量的CAR-T细胞，每微克DNA通常为10^5-10^6个拷贝，其持久性通常可达数月至数年。
来自几项实体瘤患者的肿瘤活检样本数据显示，很少有一致被识别的肿瘤内CAR-T细胞，并且这些细胞通常持久性有限，不会广泛扩增。CAR-T细胞的数量在静注后的早期(7–14天)往往最高。现有的临床数据更接近于鼠源CAR-T细胞在免疫正常小鼠中的情况，而不是人源CAR-T细胞在免疫缺陷小鼠中的状况。
图3：CAR-T细胞在选定试验中的持久性
肿瘤内CAR-T细胞的功能
基于T细胞的癌症治疗的基本目的，是提供足够数量的多功能CAR-T细胞，这些细胞能够随着时间持续靶向和消除肿瘤细胞。目前的证据表明，CAR-T细胞治疗实体瘤患者的关键问题是，太少的给药细胞可以浸润肿瘤并保持功能(图4)。在人CAR-T细胞的临床前模型中，许多细胞在早期时间点具有很高的功能性，但些细胞很少位于肿瘤内部。随着肿瘤内CAR-T细胞数量的增加，它们逐渐功能减弱，导致只有一个短暂的时间窗口内有足够数量的功能良好的CAR-T细胞(图4a)，这种情况与小鼠来源CAR-T细胞的临床前模型相似(图4b)。
图4:缺乏肿瘤内功能性CAR-T细胞限制了抗肿瘤活性
肿瘤异质性和抗原扩散
与B细胞恶性肿瘤或多发性骨髓瘤不同，实体肿瘤中抗原的表达水平较低且异质性强。因此，除非CAR-T细胞诱导某种旁观者效应或抗原扩散(antigenspreading)效应，或者多个抗原被靶向，否则成功治疗的可能性较低。但当前普遍共识认为，CAR-T细胞单独并不会引起实质性的旁观者效应，尽管最初有人猜测CAR-T细胞可能具有这样的特性。
例如，在使用同基因小鼠模型的一项临床前研究中，靶向间皮素的CAR-T细胞能够完全清除由%间皮素表达的细胞组成的肿瘤，而当肿瘤仅包含10%间皮素阴性细胞时，肿瘤便无法被完全清除，只能暂时减缓肿瘤生长。因此，大多数治疗实体瘤的CAR-T细胞临床试验，入组标准并未规定高比例的肿瘤细胞必须表达目标抗原，这是一个值得
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