ChristineH.Chung,QiangZhang,ChristinaS.Kong,JonathanHarris,ElanaJ.Fertig,PaulM.Harari,DianWang,KevinP.Redmond,GeorgeShenouda,AndyTrotti,DavidRaben,MauraL.Gillison,RichardC.Jordan,andQuynh-ThuLe
摘要
目的：虽然作为感染致癌人乳头瘤病毒(HPV)替代标志的p16蛋白表达，被认为是口咽部鳞状细胞癌(OPSCC)的预后标志，但是p16蛋白表达在包括口腔、下咽和喉部的统称为非口咽部鳞状细胞癌(非OPSCC)中的普遍性和意义还不明确，而在非OPSCC中HPV感染率低于口咽部鳞癌。
患者和方法：对RTOG、和研究中的非OPSCC患者，通过免疫组织化学技术(immunohistochemistry,IHC)和原位杂交(insituhybridization,ISH)确定p16蛋白表达和高危HPV状态。来源自Cox模型的风险比(HR)被描述为正相关和负相关，并根据不同研究分层，且根据临床特征进行校正。
结果：在RTOG、和研究中，p16蛋白表达阳性率和HPVISH阳性率在非OPSCCs中分别为14.1%(12/85)、24.2%(23/95)、19.0%(27/)和6.5%(6/93)、14.6%(15/)、6.9%(7/)。p16蛋白表达对无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的风险比(HR)分别为0.63(95%CI,0.42~0.95;P=0.03)和0.56(95%CI,0.35~0.89;P=0.01)。比较OPSCC和非OPSCC，p16蛋白表达阳性的OPSCC病人较p16蛋白表达阳性的非OPSCC病人有较好的PFS和OS，但是p16蛋白表达阴性的OPSCC病人和p16蛋白表达阴性的非OPSCC病人的预后相似。
结论：与OPSCC病人中发现的结果类似，p16阴性的非OPSCC病人的预后较p16阳性的非OPSCC的预后更差，且HPV也可能与某一亚组的非OPSCC预后有关。尽管如此，在临床广泛应用之前，需要进一步完善非OPSCC中的IHC评分系统和改进HPV检测手段。
介绍
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一种发生在头颈部各部位的异质性疾病，包括口腔、下咽和喉部。最常见的高危因素包括吸烟、饮酒和高危人乳头状瘤病毒(HPV)感染1,2。虽然根据方法的选择和研究人群对象的不同，大约在57%~72%的OPSCCs和1.3%~7%的非OPSCCs，包括口腔、下咽和喉部癌症中，HPV呈阳性3-8。
肿瘤中HPV状态可以通过几种方法确定：原位杂交(ISH)检测HPVDNA;聚合酶链式反应(PCR)，定量逆转录酶-PCR(qRT-PCR)检测HPVE6/E7RNA表达;免疫组织化学(IHC)检测肿瘤细胞中病毒基因转录指标—p16蛋白表达5-7,9-11。在以上方法中，对肿瘤细胞中病毒癌基因转录指标—HPVE6/E7RNA表达的检测，被认为是一项金标准9,10。尽管如此，和其他实验方法相比，进行qRT-PCRRNA分离，需要进行额外样品制备步骤和获取大量肿瘤细胞，目前普遍开展的实验方法是HPVISH和p16IHC。多种检测方案进行比较，在HPV感染较为普遍的OPSCC中，HPVISH和p16IHC的符合率大约为90%5。然而，在HPV感染不如口咽部中常见的口腔鳞状细胞癌(SCC)中，相对于高危HPVE6/7RNA表达，p16IHC的为敏感性为79%，特异性为93%，阳性预测值(PPV)为41%，阴性预测值为99%，说明p16IHC并不是非OPSCC中HPV感染的一个良好替代标志物7。
已经证实HPV阳性/p16阳性的OPSCC病人的预后优于HPV阴性/p16阴性的OPSCC病人5,6,11,12。尽管如此，在HPV感染或未感染的非OPSCC中，p16表达的预后意义还未明确。p16蛋白是重要的肿瘤抑制物和细胞周期调控因子13。在HPV阳性的肿瘤中，病毒蛋白E7通过cullin2泛素连接酶复合体与视网膜母细胞瘤易感蛋白(Rb)结合，并通过泛素化使Rb迅速降解14,15。Rb的缺失导致通过反馈互动方式引起的p16蛋白表达的上调16,17。尽管p16蛋白表达的上调并不特定于肿瘤蛋白E7导致的Rb缺失，因为其它与Rb功能缺失的相关的分子事件，例如RB1失活突变，缺失或者染色体丢失，可以导致相同的表型。
在此项研究中，我们分别利用IHC和HPVISH，评估在非OPSCC肿瘤中作为潜在生物学预后指标-p16蛋白的表达和HPV状况。在纳入三项前瞻性放射治疗肿瘤协作组(RTOG)研究的病人中，HPV在非OPSCC肿瘤中的感染率要低于在口咽部肿瘤中的感染率。
对象和方法
方案
RTOG是一项Ⅲ期临床试验，用以评估标准分割放疗联合顺铂与加速分割放疗联合顺铂在局部晚期NHSCC(N=)中的疗效对比5。RTOG是一项Ⅱ期随机试验，用来检测放疗联合西妥昔单抗添加顺铂或多西他赛，在改善术后具有高复发倾向的晚期NHSCC(N=)18病人的无病生存期(disease-freesurvival)方面，是否优于一组历史队列中放疗联合顺铂对病人的治疗。RTOG是一项Ⅲ期临床试验用以评估放疗联合顺铂的基础上添加西妥昔单抗在局部晚期HNSCC(N=)病人中的疗效19。
实验室研究
和此前描述一样，利用鼠源p16单克隆抗体对p16表达进行IHC检测，并确定其表达情况(predilute,mtm-CINtech,E6H4)5。当p16在大于70%的肿瘤细胞的胞核和胞质中强且弥漫表达时被认为呈阳性表达。此评分标准与Ang等人的研究标准一致5。通过采用鸡尾酒式探针(cocktailprobe)的ISH确定高危HPV状况，并通过鸡尾酒式探针(cocktailprobe)检测HPV亚型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58和66(GenPointHPVprobecocktail;Dako,Carpinteria,CA)5。当在肿瘤细胞中发现胞核特异性染色时HPVISH被定性为阳性。
统计学分析
在RTOG方案中确定了终点为无进展生存期(progression-free,PFS)和总生存(overallsurvival,OS)。未达到PFS定义为局部复发或疾病进展，远处转移或因其它原因导致的死亡。未达到OS定义为任何原因导致的死亡。率通过Kaplan-Meier方法进行评估20，并通过分层(按照不同研究)的双侧对数秩检验进行对比21。单变量和多变量风险比(HRs)通过Cox比例风险模型评估22，并按照不同研究进行分层。协同系数用来测量HPV和p16状态的相关性。
结果
p16蛋白表达和高危HPVISH状况的确定
在纳入RTOG、和的研究的例病人中，确定了例符合条件的非OPSCC病人，其肿瘤主要发生部位在口腔、下咽和喉部。在这例非OPSCC肿瘤病人中，对例进行了p16表达的检测，p16表达状况可以在90.4%(/)的肿瘤中确定。结果显示在表1中。在任何一项实验中，病人p16状况已知或未知的情况下，其特征和结果相似(附表A1，仅供在线)。总体而言，19.3%(62/)的病人p16表达为阳性。试验RTOG、和中，p16阳性的比率分别为14.1%、24.2%和19.0%。p16阳性在口腔部位肿瘤中最高，为26.3%(21/80)，随后是喉部的17.1%(31/)和下咽部的16.4%(10/61)。病人特征依据p16表达划分，在附表2中总结(仅供在线)。
在例肿瘤中共有例(45.5%)能够获取肿瘤组织，并利用ISH对其进行高危HPV检测(表1)。对此，HPV感染状况能够在95.5%的例数中确定(/)。总共有9.4%(28/)为HPVISH阳性。HPVISH阳性率在RTOG、和中的阳性率分别为6.5%、14.6%和6.9%。口腔部位HPVISH阳性率最高(13/89[14.6%]),其次是喉部(12/[7.9%])和下咽部(3/57[5.3%])。附表3中显示了根据HPVISH高危状况对病人特征进行的总结(仅供在线)，当两组试验进行比较，p16表达和HPV状况为中度相关(?系数,0.46;95%CI,0.34~0.58;表2)。当肿瘤主要发生部位在下咽部(?系数,0.54;95%CI,0.28~0.81)或喉部(?系数,0.35;95%CI,0.13~0.57)时，两组实验结果比肿瘤发生在口腔时(?系数,0.35;95%CI,0.13~0.57)的一致性更高。
基于p16表达和HPVISH状况的生存结果
我们分析了依据p16状况划分的非OPSCC肿瘤病人生存结果差异。单因素分析显示，p16表达阳性病人的PFS和OS优于p16表达阴性的病人(图1A和1B)。对于PFS，风险比为0.65(95%CI,0.44~0.98)，说明在p16表达阳性的患者中，未达到PFS的比例降低了35%(P=0.04)。对于OS，危害比为0.57(95%CI,0.36~0.90)，说明p16阳性的病人在死亡率方面低了43%(P=0.01)。此外，在调整了已知的影响预后因素如年龄、性别、T分期、N分期之后，对p16表达在PFS和OS中的影响进行了分析(表3)。经调整后，对于PFS和OS的风险比分别为0.63(95%CI,0.42~0.95;P=0.03)和(95%CI,0.35~0.89;P=0.01)。
我们同时分析了病人中基于HPVISH的生存结果差异。单因素分析显示，HPVISH阳性的肿瘤病人并不显著优越于HPVISH阴性的肿瘤病人的PFS(HR,0.77;95%CI,0.44~1.33;P=0.35)和OS(HR,0.64;95%CI,0.34~1.21;P=0.17)。此外，PFS和OS在p16阳性/HPV阳性、p16阳性/HPV阴性、p16阴性/HPV阳性和p16阴性/HPV阴性的组别中也被评估(图1E和1F)；未发现显著差异(PFS,P=0.23;OS,P=0.21),可能是由于和p16阴性/HPV阴性组(n=)相比，前三组(n=20,33,和7)样本量偏小。
不同p16状态和原发部位的生存结局
同样，我们分别研究了p16状况和3个原发部位(口腔、下咽部或喉部)与生存结局的关系。尽管由于各部的样本量小仅因为下咽部的PFS，差异达到统计学意义，研究仍提示，p16阳性的病人比p16阴性的病人结果更优(附录图A1和A2,仅供在线)。对于口腔，PFS和OS的HR分别为0.8(95%CI,0.42~1.55;P=0.52)和0.70(95%CI,0.33~1.47;P=0.34)。对于下咽部，PFS和OS的HR分别为0.61(95%CI,0.33~1.13;P=0.11)和0.54(95%CI,0.27~1.10;P=0.08)。对于下咽部,PFS和OS的HR分别为0.33(95%CI,0.12~0.96;P=0.03)和0.33(95%CI,0.10~1.09;P=0.06)。显示p16阳性者结局更优。
我们进一步分析了基于p16状况和原发部位的生存结果。将非OPSCC与OPSCC作对比，在OPSCC中p16预后标志意义已经广泛确立的前提下，分析非OPSCC中基于p16状况的生存差异。前三项RTOG试验中p16在OPSCC中的表达数据已经发布5,18,19。对于PFS和OS，p16和原发部位存在显著地相互作用。(两者相互作用P=0.01；表4;图2)。p16阳性OPSCC病人的死亡风险为p16阳性的非OPSCC病人的一半(OS:HR,0.48;95%CI,0.30~0.78)。尽管如此，即使在对其他预后变量因素进行调整后，p16阴性的OPSCC病人与p16阴性的非OPSCC病人的生存结局仍相似(OS:HR,0.97;95%CI,0.74~1.24)。虽然这些数据引发白癜风有治疗好的吗北京白癜风断根治疗的医院
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