靶点解惑抗体浓度通透处理盘点

CD31，Ki67与NLRP3由于蛋白本身的性质，在实验中需要特别注意。小编整理了在不同实验中检测这3个蛋白的注意事项，帮助您获得预期实验结果。

01

CD31实验关键点

CD31简介

▲图1.CD31蛋白结构图。*图片来源：?SWISS-MODELCD31是一个83kD的跨膜蛋白，参与炎症反应中白细胞的跨内皮迁移（TEM），同时还是内皮细胞连接中含量最多的组分。小编整理了以下关于CD31的实验注意事项：

?CD31的WB检测

?CD31的IHC-P检测

?CD31的ICC/IF检测

CD31的WB检测

在WesternBlot实验中，样本准备是实验成功的第一步。

1.

裂解样本时加入足量的蛋白酶抑制剂防止蛋白降解。

2.

使用Bradford，Lowry或BCA法对总蛋白进行定量。

3.

每个泳道加入20-50μg总蛋白，确保CD31含量在WB检测限之上。

背景过高是WesternBlot中常常出现的问题。对于此类问题，建议优化抗体浓度以获得最佳的信噪比（图2）：▲图2.不同浓度?ab检测小鼠肺裂解液结果Lane1：一抗1:稀释Lane2：一抗1:稀释

CD31的IHC-P检测

组织块从生物体上取下后由于酶的作用会迅速降解。固定的目的是通过化学试剂的作用使蛋白交联（多聚甲醛，福尔马林等）或沉淀（乙醇），防止组织自溶，维持抗原性并防止抗原弥散。过度固定会封闭抗原表位，导致信号减弱甚至消失。一抗的浓度对于实验结果非常重要。浓度过低得不到阳性信号，浓度过高可能产生非特异性结合，造成假阳性。为获得理想的染色结果，建议：

1.

根据组织块大小和类型确定固定时间，一般在4%多聚甲醛（PFA）或10%中性福尔马林（NFB）固定18-24小时。

2.

第一次使用抗体时建议根据说明书优化抗体浓度或稀释比例。

▲图3.人脾脏CD31染色结果。枸橼酸钠（pH6）热修复20分钟。一抗?ab，5μg/ml，室温孵育15分钟。

CD31的ICC/IF检测

与组织块相比，培养的细胞需要固定的时间更短，同时醛基的自发荧光对于荧光检测常常带来干扰。

为了获得更好的实验结果，推荐：

1.

使用4%PFA固定细胞20分钟，过度固定会使信号减弱。

2.

使用0.3M甘氨酸淬灭醛基引起的自发荧光。

▲图4.HUVEC细胞CD31染色结果。细胞在4%PFA中固定10分钟，使用0.1%TritonX-通透5分钟。使用1%BSA/10%normalgoatserum/0.3M甘氨酸/PBST封闭1小时。一抗?ab，1μg/mL，4℃过夜孵育。

02

Ki67实验关键点

Ki67简介

▲图5.Ki67蛋白结构。*图片来源：?WikipediaKi67最早发现于霍奇金淋巴瘤的细胞核中。它在细胞增殖活跃期（G1,S,G2及有丝分裂期）位于细胞核里，而在G0期无法检测到。Ki67常被作为细胞增殖的生物标志物。小编整理了以下改善Ki67实验结果的小贴士：

?Ki67的IHC-P检测

?Ki67的ICC/IF检测

Ki67的IHC-P检测

Ki67定位于细胞核，因而在IHC实验中需要特别注意以下事项，以获得理想的实验结果：

1.

推荐使用pH6的枸橼酸钠，热修复20-30分钟或使用胰蛋白酶、蛋白酶K进行酶修复。

2.

若切片厚度大于5μm，推荐使用0.2%TritonX-PBS对切片进行通透处理10分钟。

▲图6.使用?ab对人扁桃体样本进行染色。pH6枸橼酸钠热修复20分钟。使用LeicaBONDTM系统方法F检测。一抗1:，室温孵育15分钟。

Ki67的ICC/IF检测

由于定位在细胞核中，在ICC/IF实验中检测Ki67需要通透处理，以便于抗体进入细胞。对不同的样本类型，不同的抗体进行浓度优化也是提高成功率的重要方法。我们整理了在ICC/IF实验中的注意事项，确保得到预期的实验结果：

1.

对于核蛋白，推荐在4%PFA中室温固定20分钟。过度固定会使信号减弱。

2.

检测细胞核内抗原时，使用0.1%TritonX-对细胞进行5分钟的通透处理（图7）。

▲图7.不同处理与抗体稀释比例下在HepG2中检测Ki67（?ab）实验结果

A.

一抗1:50，0.1%TritonX-通透5min

B.

一抗1:，0.1%TritonX-通透5min

C.

一抗1:50，未通透处理

D.

一抗1:，未通透处理

03

NLRP3实验关键点

NLRP3简介

▲图8.NLRP3蛋白结构。*图片来源：?SWIISS-MODELNLRP3基因获得功能性突变与统称为冷卟啉相关周期性综合征（CAPS）的疾病相关，其中包括Muckle-Wells综合征、家族性冷性自身炎综合征、新生儿发作多系统炎症等。NLRP3炎性体识别并响应众多的细菌、病毒、真菌与寄生虫感染。NLRP3也与许多慢性病相关，如关节炎，缺血性心脏和肾脏疾病，血管疾病，糖尿病和肥胖症，阿尔茨海默氏症等。

NLRP3的WesternBlot检测

我们整理了以下小贴士，在进行WesternBlot实验时需要特别注意：

1.

当NLRP3在样本中表达量过低时，可尝试用LPS或PGN处理（图9）。

2.

该蛋白理论分子量约kD，可在在转膜液中加入终浓度0.1%的SDS以提高转膜效率。

3.

在样本中加入蛋白酶抑制剂，防止蛋白降解。

4.

优化一抗浓度以获得更好的实验结果（图10）。

▲图9.不同浓度LPS或PGN处理小鼠腹膜巨噬细胞结果。图片修改自YuQiao,PengWang,JianniQi,LeiZhang,ChengjiangGao.TLR-inducedNF-κBactivationregulatesNLRP3expressioninmurinemacrophages.FEBSLettApr5;(7):-6.▲图10.不同浓度?ab检测THP-1裂解液结果Lane1：一抗1:稀释Lane2：一抗1:稀释

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