局部晚期食管腺癌放化疗后的动态和瞬时免疫

目的:本研究的目的是评估放化疗对免疫微环境的影响，以影响和优化设计未来的新辅助临床试验。

背景资料：程序性死亡（PD）-1抑制剂在程序性死亡配体-1(PD-L1+)的胃食管转移癌中有效率约为25%。不幸的是，在大多数患者身上不起效果。因此，在早期食管癌中联合免疫治疗和放化疗的基本策略或许可以预防患者的转移性疾病。

试验方法：采用免疫组织化学、定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)和肿瘤浸润淋巴细胞功能分析等方法，检测放化疗前后食管腺癌细胞的免疫微环境，以探讨放化疗对已切除的食管腺癌治疗效果的影响。此外，为了评估辐射诱导的PD-L1上调的持续时间和依赖性，使用了食管腺癌的手术大鼠反流模型。首先，给荷瘤动物单次13Gy或16Gy照射，再用qRT-PCR检测放射后的安全性、剂量相关性和PD-L1上调。其次，在基准量、16Gy照射后1周、5周和9周，使用系列内窥镜活组织检查确定个体动物体内纵向PD-L1表达水平。

结果：绝大多数肿瘤在肿瘤间质界面表现为增强的干扰素γ和活化的CD8+淋巴细胞。这些肿瘤还表现出PD-L1和多个其他免疫检查点(包括TIM3，GITR，IDO1，LAG3，OX40和KIR)的增强和上调。动物模型结果表明PD-L1上调是剂量依赖性的，辐射暴露后短暂升高。

结论：总的来说，这些发现对放化疗后免疫景观演变提供了见解，并对将放疗与免疫检查点抑制剂结合的新辅助试验设计具有着重要意义。

关键词：化疗放射，食管腺癌，免疫微环境，PD-L1

程序性死亡配体-1(PD-L1)上调发生在大约40%的胃食管肿瘤(GECs)，但不同于其他实体瘤，其中PD-1抑制剂是食品和药物管理批准的(黑色素瘤，肺癌或肾细胞癌)，很少有PD-L1表达的胃食管癌细胞。相反，PD-L1主要表达在浸润边缘的浸润性骨髓细胞上。1-3此外，还发现了具有不同免疫特征的胃食管肿瘤，特别是EB病毒(EBV)阳性和微卫星不稳定性(MSI)的肿瘤。4约有10%的胃癌为EBV+，肿瘤细胞和免疫细胞分别约有50%和94%的PD-L1+染色。4错配修复缺陷也影响PD-L1+的状态，分别有33%和45%的病例肿瘤细胞和免疫细胞阳性，两种亚型的PD-L1+免疫细胞都有肿瘤浸润。4PD-L1在肿瘤微环境中的表达定位和浸润性免疫细胞在浸润边缘或肿瘤核心的表达模式可能影响其作为胃食管肿瘤生物标志物的应用，但需要更多的数据。最近的研究强调了肿瘤新抗原景观的相关性以及这可能如何影响对检查点敏感性的抑制。同时具有高克隆新抗原负荷和低新抗原瘤内异质性的肿瘤与富含活化效应T细胞的炎症肿瘤微环境、更高的PD-L1表达和显著更长的无进展生存期相关。5除此之外，有回顾性研究表明，干扰素介导的适应性免疫反应与黑色素瘤和头颈部肿瘤对PD-1抑制剂的反应有关。6,7PD-L2在51.7%的食管腺癌（EACs）中有表达，但对其他检查点抑制剂的表达及放化疗等治疗手段的潜在诱导作用知之甚少。

肿瘤中免疫浸润的多样性早就被认识到并具有预后意义，但辐射的作用及其对免疫微环境的影响尚不清楚。8我们假设在可手术的食管肿瘤中新辅助放化疗可能诱导更多的干扰素γ（IFNγ）和PD-L1表达，尽管是暂时的，并且增强CD8T细胞在肿瘤/间质界面处浸润。无论这种情况是否发生，PD-L1上调的程度、辐射剂量依赖性以及其他免疫检查点的诱导仍然是未知数。在本研究中，我们采用了已建立的改良大鼠模型，将大鼠端侧食管空肠吻合术诱导慢性胃十二指肠食管反流（GDER）以及食管腺癌的发生。该模型在研究食管腺癌中具有重要的应用，因为它具有跨物种癌症途径的保护作用，并且有利于临床前药物的开发。9-12然而，PD-L1的表达和免疫反应的评估至今还没有很好的定性。13-16据我们所知，这是第一个在一个新的临床前模型中进行暂时分离的内镜活检以确定不同剂量辐射下PD-L1上调的程度和持续时间，并确定切除的人食管腺癌中CD8T细胞浸润的程度和定位以及放化疗前后IFNγ的变化。此外，我们还评估了其他免疫检查点，尤其是TIM3、GITR、IDO1、LAG3、CD、OX40和KIR在放化疗前后人体样本中是否上调。

试验方法

临床伦理学声明

研究是在机构批准下进行的（宾夕法尼亚州医院评审委员会协议#16–）。所有患者样本均已获取书面知情同意书，所有样本均取自病理诊断完全后残留的组织。采集的样本包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）正常食管上皮（n=15）例，配对新辅助治疗前和术后的内镜活检（食管切除样本）新辅助治疗样本局部晚期食管腺癌病（n=31）例。

激光捕获显微切割与基因表达

福尔马林固定石蜡包埋样本由委员会认证的病理学家进行检查，以确定食管腺癌的区域。简单地说，对所有样本进行激光捕获显微切割（LCM）以收集肿瘤上皮细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和间质髓样细胞，并且如先前所述的方式收集。17从LCM收集的组织中提取总RNA，其中包括了miRNA，反转录RNA，如前所述进行预扩增，根据制造商指南制作cDNA。17根据制造商的指南，使用以下RT2引物进行RT-PCR：IFNγ(Qiagen,Valencia,CA#PPHC),TIM3(Qiagen,Valencia,CA#PPHA),GITR(Qiagen,Valencia,CA#PPHB),IDO1(Qiagen,Valencia,CA#PPHB),LAG3(Qiagen,Valencia,CA#PPHA),CD(Qiagen,Valencia,CA#PPHE),OX40(Qiagen,Valencia,CA#PPHA),KIR(Qiagen,Valencia,CA#PPHA)。使用ΔΔ-Ct法计算相对基因表达。选择SNORD95和miR-16作为内源性对照，RTC作为每一盘的标准对照。进行组间比较，并与病理证实的LCM正常食管样本进行对照。所有的实验都是可重复的。

免疫组织化学

对食管腺癌福尔马林固定石蜡包埋样本进行PD-1，CTLA-4和CD8染色，分别使用22C3免疫组织化学试剂（IHC）pharmDx(Dako,Carpinteria,CA;#SK)，CTLA-4抗体(SantaCruz,Dallas,TX;#SC-)，CD8抗体(ThermoFisherScientific,Waltham,MA;#RB--P0)。简单地说，使用显微镜用薄片切片机将组织切成4-5.6μm的部分。使用VentanaBenchMarkULTRA自动染色仪(Ventana,Tucson,AZ;#N-BMKU-FS)对PD-L1（22C3克隆）、CTLA-4和CD8进行免疫组织化学染色。PD-L1是预先稀释和使用的。CTLA-4和CD8分别稀释为1:和1:50来使用。使用标准的临床自动程序对载玻片上的样本进行染色。PD-L1和CTLA-4在肿瘤或淋巴细胞染色1%时，为染色阳性。此外，根据显示阳性细胞所需的放大倍数来测量强度，定义弱（20×）、中等（10×）和强（4×）。对于CD8染色，使用3个选定的显微镜视野对每个样本进行定量密度分析，并计算每个肿瘤细胞中染色的CD8+细胞的数量。18扁桃体、淋巴结和肿瘤对照组织分别作为CD8、CTLA-4和PD-L1的阳性对照。评分由委员会认证的对于病例解释不一致的两名病理学家在盲法的情况下进行。

动物伦理学声明

所有动物研究均经宾夕法尼亚州医院机构动物护理和使用委员会批准，按照号方案进行（Protocol#）。按照“实验动物护理和使用指南”中规定的标准，为所有实验动物提供人道护理。

动物PD-L1上调研究——实验设计

剂量的选择是基于对先前描述的肿瘤动物模型的放射后毒性特征和PD-L1上调的文献综述所定。19,20

(SupplementalFigure1,